Коллектив авторов - Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии

• Название: Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии
• Автор: Коллектив авторов
• Жанр: Медицина

В этой книге в краткой форме изложен материал, необходимый для освоения современных методов конфокальной лазерной микроскопии. Часть из описанных в тексте практических приемов разработана и усовершенствована авторами издания. Отличительной особенностью данной книги является сочетание ключевых моментов из теории современных методов микроскопии с примерами использования различных приемов конфокальной микроскопии и иммуноцитохимии на практике. В приложениях приводятся необходимые сведения о спектральных характеристиках флуорохромов и протоколы иммуноцитохимических реакций, использованных авторами для получения изображений препаратов и построения трехмерных реконструкций микроскопических объектов.

Настоящее руководство может являться справочным пособием для специалистов, применяющих в своей работе флуоресцентные методы и конфокальную микроскопию, а также будет полезно для студентов биологических и медицинских факультетов, изучающих морфологические и нейробиологические дисциплины.

---

Литература

Голышевская В. И., Егорова О. В., Севастьянова Э. В., Шульгина М. В. Люминесцентная микроскопия: учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». – М.; Тверь: Триада, 2008. – 36 с.

Лукашева Н. Н., Ткаченко С. Б., Потекаев Н. Н., Кузьмина Т. С., Василевская Е. А. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 5. – С. 10 – 15.

Манцызов Б. И. Когерентная и нелинейная оптика. – М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009. – 208 с.

Олейников В. А. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорг. химия. – 2011. – 37 (2). – С. 171 – 189.

Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: учебно-методическое пособие. – СПб.: СОЛО, 2008. – 72 с.

Соболев А. С. Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – № 4. – С. 2 – 6.

Феофанов А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 371 – 410.

Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике :в9 т. – 6-еизд. сущ. испр. – М.: УРСС: Издательский дом «ЛИБРОКОМ», 2011. – Т. 3: Излучение. Волны. Кванты. – 264 с.

Штейн Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии. – СПб.: ИНЦ РАН, 2007. – 77 с.

Dailey M. E., Manders E., Soll D., Terasaki M. Chapter 19 Confocal Microscopy of Live Cells In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 381 – 404.

Grigsby C. L., Ho Y. P., LeongK. W. Understanding nonviral nucleic acid delivery with quantum dot-FRET nanosensors // Nanomedicine (Lond). – 2012. – Vol. 7 (4). – P. 565 – 577.

Ishikawa-Ankerhold H. C., Ankerhold R., Drummen G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques – FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM // Molecules. – 2012. – Vol. 17. – Р. 4047 – 4132.

Nair B. J., Sivakumar T. T., Joseph A. P., Varun B. R., Mony V. Confocal microscopy // Health Sciences. – 2012. – 1(3): JS004A. – Р. 1 – 6.

Tsien R. Y., Ernst L., Waggoner A. Fluorophores for Confocal Microscopy: Photophysics and Photochemistry In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 338 – 352.

Zeug A., Woehler A., Neher E., Ponimaskin E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches – a comparative snapshot // Biophys. J. – 2012. – Vol. 103 (9). – Р. 1821 – 1827.

Глава 2. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ДРУГИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

В современных морфологических исследованиях, в случае использования флуоресцентной микроскопии и конфокальной лазерной микроскопии, для окрашивания препаратов применяют различные флуоресцентные красители. При проведении иммуноцитохимических исследований связанные с клеточными и тканевыми антигенами антитела выявляются благодаря включению флуоресцентной метки. Флуоресцирующие вещества, используемые в качестве флуоресцентной метки, присоединенной к нефлуоресцирующим молекулам (нуклеотидам, пептидам, антителам), а также флуоресцентные красители принято называть флуорохромами. Флуоресцентные красители и другие флуорохромы способны расходовать часть энергии поглощенного излучения на флуоресценцию (излучение определенной длины волны) при возвращении из возбужденного состояния в стабильное. Каждый флуорохром обладает индивидуальным спектром излучения и поглощения, наиболее интенсивная флуоресценция наблюдается при облучении красителя светом с длиной волны, близкой к характерному для него максимуму поглощения.

Флуоресцентные красители применяются для выявления биологических макромолекул (белки, нуклеиновые кислоты) или определенных органелл клетки, таких как митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, а также для выявления клеточного ядра. Для окраски живых объектов применяются такие красители, которые могут проникать в живые клетки, не вызывая их повреждения. Часть существующих красителей (не проникающих в живые клетки либо токсичных для них) используется только для окраски фиксированных биологических объектов. Другие флуоресцирующие вещества (флуоресцентные индикаторы) используются для мониторинга динамических процессов в живых клетках (определение концентрации неорганических ионов, рН, активных форм кислорода и мембранного потенциала). Флуоресцентные красители также широко применяются при определении целостности клеток, при изучении эндо- и экзоцитоза, текучести мембран, межклеточной коммуникации и ферментативной активности клеток. Флуорохромы, взаимодействующие с нуклеотидами, нашли широкое применение в области молекулярной генетики и при проведении цитогенетических исследований.

Использование лазерной конфокальной микроскопии для изучения объектов, подвергнутых окраске флуоресцентными красителями, дает возможность определять локализацию специфических молекул и органелл с высокой точностью. Сочетание нескольких красителей и флуоресцентных меток с различными параметрами излучения позволяет проводить двойную, тройную (и более) маркировку с целью обнаружения нескольких молекулярных компонентов в одном образце.

Некоторые низкомолекулярные органические красители проявляют сродство к определенным биомолекулам и клеточным органеллам. Это явление используется для селективной флуоресцентной окраски. Так, например, амилоидные структуры флуоресцируют при взаимодействии с тиофлавинами (Коржевский Д. Э. [и др.], 2013). Флуоресцентный краситель Нильский красный (Nile Red) используется для определения локализации нейтральных липидных включений в клетках. Nile Red имеет яркую флуоресценцию в неполярных средах (максимумы возбуждения/излучения 552/636 нм). Красители BODIPY также используются при окраске нейтральных липидов. Отложения солей кальция в костях, хрящах и минерализованных опухолях при взаимодействии с тетрациклином проявляют желтую флуоресценцию. Для окраски митохондрий клетки инкубируют с красителями Mitotracker, которые пассивно диффундируют через плазматическую мембрану и накапливаются в митохондриях живых клеток. Помимо митохондриальных маркеров синтезированы также красители Lysotracker, выявляющие лизосомы. Краситель DiOC6 применяется для селективного окрашивания эндоплазматической сети. С аналогичной целью используют соединения из группы ER-Tracker.

2.1. Ядерные флуоресцентные красители

Для облегчения идентификации клеток и тканей, а также для определения положения, формы клеток, их апоптозных изменений, фазы митотического цикла в исследованиях, проводимых с применением лазерной конфокальной микроскопии и обычной флуоресцентной микроскопии, используется окраска ядер клеток соответствующими флуоресцентными красителями. Окрашивание ядра клетки значительно облегчает ориентировку в изучаемых препаратах и позволяет регистрировать ряд морфологических параметров, связанных с функциональным состоянием клетки (размеры ядра и ядрышка, состояние хроматина).

При флуоресцентной микроскопии ядерную ДНК, как правило, окрашивают DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндолом). DAPI специфически связывается с ДНК и обладает синей флуоресценцией при возбуждении ультрафиолетовым светом ртутной лампы. При проведении конфокальной микроскопии флуоресценцию DAPI необходимо возбуждать ультрафиолетовым аргоновым лазером (360 нм) или мультифотонным (фемтосекундным пульсирующим) лазером. Диодный лазер (405 нм), которым обычно комплектуются бюджетные варианты конфокальных микроскопов, для этих целей непригоден. В этом случае вместо DAPI используют другие флуоресцентные красители. Их выбор в настоящее время достаточно широк (Приложение 1).

С точки зрения химической организации выделяют четыре основные группы флуоресцентных красителей, применяемых для окрашивания нуклеиновых кислот (НК):

1. Наиболее часто применяются цианиновые (полиметиновые) красители. Они имеют в качестве флуорофорной системы группы – СН=, образующие цепь сопряженных двойных связей с электронодонорной и электроноакцепторной группами на концах. Цианиновые красители образованы двумя ароматическими или азотсодержащими гетероциклическими кольцами, соединенными полиметиновой цепью двойных сопряженных углерод-углеродных связей. Выделяют симметричные (полиметиновые красители, содержащие одинаковые гетероциклы на концах полиметиновой цепи) и несимметричные. По количеству метиновых групп различают: цианиновые красители с одной метиновой группой – монометинцианины, красители с тремя метиновыми группами – триметинцианины (карбоцианины), симметричные цианиновые красители с более длинной цепочкой метиновых групп – полиметинцианины (поликарбоцианины). Также существуют мономерные и димерные цианиновые красители.

2. Фенантридины (этидия бромид, пропидия йодид ).

3. Акридины (акридиновый оранжевый, акридиновый красный, акридиновый желтый).